IPHASE/汇智和源 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验热点问题解答【上】

体外哺乳动物细胞染色体畸变试验常见问题与解答

—热点问题—

第一题    细胞被“黑胶虫"污染了该如何处理？

如果培养的细胞被“黑胶虫"污染，需先去评估污染的严重程度。如果污染不严重，可选用市售的“黑胶虫"清除试剂进行处理；如果污染较严重，建议直接丢弃该细胞，分析造成“黑胶虫"污染的原因并进行治理。

第二题    CHL细胞为试验系统，细胞准备时推荐的接种密度是多大？接种后培养多久可以开始染毒？

本公司使用T25瓶进行试验，接种密度为6~9×10^4/mL，接种量为5mL，即每瓶细胞量是3×10^5个~4.5×10^5个。一般情况下，接种后24h左右细胞的融合率可达到80%即可进行染毒，如果融合率不够，也可以继续培养直至满足试验需求。

第三题    一般如何确定秋水仙素的浓度和处理时间??？

秋水仙素剂量大，则作用时间短；秋水仙素剂量小，则适当延长作用时间。本公司使用的秋水仙素浓度是1μg/mL，4h。

第四题    秋水仙素工作的机理是什么？

秋水仙素可以抑制纺锤体的形成，导致纺锤丝无法捕捉到着丝粒而造成染色体不能向细胞两极移动。同时，秋水仙素处理后，染色体将会不能排列在赤道板，所以在细胞中会散乱分布。

第五题    细胞收集量少是什么原因导致的？如何优化？

细胞收集量少的原因主要有以下几点：

（1）酶消化过程消化不干净；

（2）离心速度过低，细胞不能沉淀，导致细胞丢失；

（3）铺板细胞量不够；

（4）样品对细胞有毒性，细胞死亡。

优化策略：

（1）酶消化过程需于显微镜下观察，确保消化完；

（2）适宜的离心条件，通常250g，5min;

（3）细胞悬液需混合均匀，必要时多次计数；

（4）如有需求，请于正式试验前开展预试验。

第六题    低渗目的是什么？有什么注意事项？

在低渗环境中，细胞易吸水膨胀，染色体铺展，以便能在一个平面上观察所有染色体形态，为后续染色做准备。在低渗过程中我们需要注意以下几点：

（1）低渗时间。低渗时间过长，可引起细胞破裂，染色体丢失；低渗时间不足，细胞膨胀度不够，染色体聚集，分散不好，不利于阅片。本公司低渗是使用0.075mol/L的氯化甲溶液37℃水浴30~40min。

（2） 细胞操作需轻柔。低渗后的细胞会胀大，通透性增强，细胞操作过程一定要轻柔，以防细胞破裂。

（3）离心条件需适合。低渗后细胞膨胀，离心力过高，细胞容易破裂，导致染色体丢失；离心力过低，细胞不能沉淀，收集不到细胞。

第七题    细胞在固定过程中丢失是什么原因导致的？

细胞在固定过程中丢失可能是因为离心速度过低，细胞不能沉淀或沉淀不够，在更换固定液的过程中导致细胞丢失。

第八题    每次固定的时间是多久？固定几次比较合适？

本公司使用的是预固定加重复固定的方法。预固定在低渗结束前进行，一般3~5min，步骤虽简单却不能省略，可有效预防细胞因加入大量的固定液而凝结成块。固定步骤共重复3次，一般30±5min。

第九题    玻片干燥怎么操作？

可于室温下自然干燥，也可于37℃干燥箱中烘干。

第十题    使用吉姆萨染液同样条件下染片，为什么会出现有的片子是蓝色的，有的是红色的？

根本原因是因为染色过程中pH的变化。吉姆萨染液由天青，伊红组成，所带电荷随溶液PH而定。在偏酸性环境中下在电荷增多易与伊红结合染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多,易与美蓝或天青结合,染色偏蓝。

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